Polymerase Chain Reaction

Vaak bevatten monsters te kleine hoeveelheden DNA om direct mee te werken. Dankzij de PCR-techniek kunnen we nu het DNA in een monster vermenigvuldigen. Het PCR apparaat is eigenlijk niets meer dan een heel nauwkeurig verwarmings- en koelapparaat met daarin de buisjes met het DNA-monster en andere ingrediënten die noodzakelijk zijn voor de reactie.
Deze ingrediënten zijn
- losse nucleotides (A's, T's C's and G's),
- korte enkelstrengs DNA moleculen de zogenaamde primers
- Een enzym met de naam Thermus aquaticus polymerase (Taq polymerase). Taq polymerase is afkomstig van bacterie Thermus aquaticus die leeft in hete bronnen en dus in het bezit van enzymen die bij zeer hoge temperaturen werkzaam zijn, zodat het enzym de (herhalende) denaturatiestappen in onderstaand proces overleeft en vervolgens zijn (DNA verlengende) werk kan doen.

Het proces bestaat uit drie stappen:

  • Denaturatie: Het verwarmen van het monster tot een temperatuur van ca 90-95ºC, waardoor elke dubbele streng DNA zich splitst in twee enkele strengen.
    Oorzaak: de waterstofbruggen die de complementaire strengen "bij elkaar houden" zijn veel zwakker dan de covalente bindingen tussen de nucleotides binnen een keten. Het verhitten verbreekt de waterstofbinding waardoor de dubbele streng uit elkaar gaat terwijl de covalente (keten)bindingen onaangetast blijven.
  • Hybridisatie: Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd, wat de DNA-primers in staat stelt zich aan de gescheiden ketens te binden. De primers binden zich omdat ze complementair zijn aan bepaalde (specifieke) volgordes van elke streng die naast het DNA-stuk liggen dat moet worden gerepliceerd.
  • Verlenging: Zodra de primer zich gehecht heeft gaat het Taq polymerase het DNA verlengen waarbij de losse nucleotides gebruikt worden. Het uiteindelijke resultaat is een complementaire keten op elk oorspronkelijke enkele keten. In deze eerste cyclus is het oorspronkelijk aanwezige DNA verdubbeld.

In de volgende cyclus wordt opnieuw verhit en afgekoeld waardoor de nieuwe dubbele strengen gescheiden worden en elk afzonderlijk gekopieerd door het Taq polymerase. In elke stap, cyclus, wordt het aantal strengen van het gewenste stuk DNA verdubbeld. Na ongeveer 30 cycli (wat enkele uren duurt), zijn er genoeg DNA kopieën voor verder onderzoek aanwezig.

Zie ook animatie.

Een nieuwere methode waarbij tijdens de PCR het DNA al kan worden aangetoond is de real time PCR methode. Hierbij worden primers gebruikt met een "label" dat pas zichtbaar wordt als de primer wordt gebruikt : het label komt vrij er wordt licht van een bepaalde golflengte uitgezonden en dat wordt (real time) gemeten. Hoe meer DNA wordt omgezet hoe groter het signaal. Hoe meer DNA in het begin, hoe sneller de detectiegrens wordt bereikt. Uit de grafiek (verband tussen hoeveelheid DNA en detectietijd) kan worden berekend hoeveel DNA er in het begin aanwezig was . Dit is een snelle methode om bacteriën, virussen, en schimmels aan te tonen. Ook kan de herkomst van vlees, paard?, rund? varken?, kan zo snel worden vastgesteld.

PCR schema

Een echte aanrader: Je kunt zelf op je computer ook een PCR uitvoeren:
zie http://www.hhmi.org/biointeractive/bacterial-identification-virtual-lab
een goede voorbereiding op het labwerk zelf, je begrijpt de principes en je ziet ook de valkuilen van de bepaling.

Lees meer over het nieuwe DNA laboratorium van het NAK

Grote voordeel : je kunt bepalingen versnellen, de DNA vermeerdering vervangt incubatiedagen en de identificatie met een voedingsbodem kan worden overgeslagen:

Bijvoorbeeld bij Salmonella:

klassieke methode snelle methode
dag 1 monster
resusciteren= herstel
dag 1 monster
resusciteren+herstel
dag 2 ophoping dag 2 ophoping
dag 3 PCR methode

dag 3 isolatie

  dag 4 reinkweek
  dag 5 identificatie
  dag 6 bevestiging