Virussen op het lab


Kweek en identificatie van virussen
Omdat een virus zich niet buiten een gastheercel kan vermeerderen is het moeilijker (dan bij bacterien) om ze te kweken, hun aanwezigheid te ontdekken , ze te identificeren, en te bepalen hoeveel er zijn.
Willen we een virus laten groeien dan moeten we hem levende cellen geven in plaats ven een voedingsbodem met daarin opgeloste voedingsstoffen.
Virussen met een bacterie als gastheercel zijn tamelijk eenvoudig te kweken in of op een bacteriecultuur. Reden waarom er veel bekend is over de virusvermeerdering van bacteriofagen.
Gastheren als planten en dieren zijn moeilijker om onder goed gecontroleerde omstandigheden te houden en dit is ook veel kostbaarder. Vooral ziekteverwekkende virussen bij mens en hogere diersoorten zijn daarom moeilijk te kweken en te bestuderen.
Achtereenvolgens zal van

  • de bacteriofagen,
  • de dierpathogene virussen en
  • plantenvirussen

worden besproken hoe ze gekweekt worden en hoe ze (kwalitatief en kwantitatief)bepaald worden

Bacteriofagen
De kweek van bacteriofagen
Bacteriofagen kunnen gekweekt worden door ze in een jonge (vloeibare) cultuur van een gevoelige bacterie te brengen. Groeien de fagen dan zal de cultuur na verloop van tijd helder worden. (een controlecultuur=zonder faag juist troebel)

De bepaling van de hoeveelheid bacteriofagen
De kweek op een vaste voedingsbodem maakt het mogelijk om de fagen ook te tellen. Een monster met bacteriofagen wordt gemengd met een suspensie van de gastheerbacterie en vloeibaar agarmedium .Het mengsel wordt uitgegoten op een gestolde voedingsbodem. Het faag-bacteriemengsel stolt in een dunne toplaag waarbij de bacteriecellen naast elkaar liggen ongeveer één cel dun.
Elk virus infecteert een bacterie, vermeerdert zich en produceert enkele honderden nieuwe virussen. Deze infecteren weer nieuwe bacteriecellen in de onmiddellijke omgeving etc., etc.. Hierdoor ontstaan plaatselijk met het oog zichtbare kale plekken in het verder troebele bacteriedek. Deze kale plekken worden plaques genoemd. Het aantal plaques is een maat voor de hoeveelheid aanwezige fagen . Als er 1 milliliter monster op de plaat is gebracht en er ontstaan 100 plaques dan is de concentratie 100 fagen per milliliter (ml) .De bepaling is te vergelijken met de kiemgetal bepaling van bacteriën. Zo geldt nu ook dat er niet te veel en aan de andere kant niet te weinig plaques op een plaat aanwezig moeten zijn. Bevat een monster vermoedelijk erg veel fagen dan zullen ook verdunningen ingezet moeten worden

Dierpathogene virussen

Kweek van dierpathogene virussen
In levende dieren
Sommige virussen kunnen alleen in levende dieren gekweekt worden zoals in muizen, konijnen en cavia's. Er zijn ook humane virussen die niet in dieren gekweekt kunnen worden of wel gekweekt maar zonder dat er een ziekte ontstaat. Het ontbreken van een diermodel bij AIDS (HIV virus) heeft onze kennisverwerving sterk vertraagd en maakte onderzoek naar geneesmiddelen die de vermeerdering van het virus remmen onmogelijk.
In 1990 vond men een methode waarbij muizen met HIV geïnfecteerd konden worden en daadwerkelijk AIDS kregen: deze muizen waren genetisch gemodificeerd en zo in staat menselijke T-cellen en menselijke antistoffen te maken.

In kippenembryo's(bevruchte bebroede kippeneieren)
Als het virus kan groeien in een kippenembryo, dan is daar een tamelijk gemakkelijke en relatief goedkope dierlijke gastheer. Er zijn diverse membranen in het ei waarop het virus kan groeien Nadat het virus op de (voor deze soort) juiste plaats is geïnjecteerd>wordt na enige dagen de virusgroei zichtbaar door soortspecifieke symptomen. Deze methode was eens de meest gebruikte methode en wordt nog steeds voor sommige vaccins (influenza) op grote schaal toegepast.

Celkweek
Voor veel virussen is de kippenembryotechniek vervangen door de celkweek. Een celkweek bestaat uit een verzameling gelijke cellen en kan bijna net zo gemakkelijk gekweekt en gehanteerd worden als een bacteriecultuur en is zo minder bewerkelijk en kostbaar als het werken met dieren of kippenembryo's celkweek wordt gestart door een stukje dierlijk weefsel te behandelen met enzymen die de cellen los van elkaar maken. De cellen worden gesuspendeerd in een vloeistof met de juiste osmotische waarde, de nodige voedingsstoffen, een pH-indicator en in de meeste gevallen een antibioticum.( Bij omslag van de pH-indicator wordt weer overgeënt). Zo'n celcultuur en alle celculturen die daarvan "afstammen" noem je een cellijn.
Ook hier zijn suspensieculturen mogelijk waarmee een hoge virusopbrengst wordt verkregen. Veel cellijnen sterven af na enkele malen overenten. Bepaalde cellijnen afkomstig van embryo,s kunnen zo'n honderd keer worden overgeënt.
Er zijn ook continue cellijnen, deze zijn onsterfelijk en kunnen een oneindig aantal keren worden overgeënt. Een beroemd voorbeeld is de HeLa cellijn, geïsoleerd uit een tumor ( voor belangstellenden is er een video ).. Na jarenlange cultuur zijn veel van de eigenschappen veranderd maar de kweek van virussen is nog steeds mogelijk.

Identificatie en  kwantitatieve bepaling van het aantal dierpathogene virussen

Cytopathogene effect
Normale cellen hebben de neiging zich te hechten aan de glazen of plastic fles en vermeerderen zich tot een één cel dikke laag: een monolayer.
Virussen die zo'n monolayer infecteren veroorzaken soortspecifieke schade aan de cellen, dit schadelijke effect wordt ook wel het cytopathogene effect genoemd. Dankzij deze kenmerken kan men een virus identificeren.
Deze plekjes in een monolayer kunnen geteld worden, zodat ook een telling (kwantitatieve bepaling) mogelijk is.

Immunochemische bepaling
 De meest toegepaste bepalingen van virussen zijn de immunochemische bepalingen: bepalingen waarbij men gebruikt maakt van de specifieke binding tussen antistof en antigen, in dit geval een antigen gelegen op het betreffende virus. Bij het stellen van een diagnose bij mens of dier kan het ook zo zijn dat men niet op zoek gaat naar het virus maar dat men het bloed van de te onderzoeken persoon onderzoekt op de aanwezigheid van antistoffen gericht tegen een bepaald virus. Is de hoeveelheid antistoffen hoog>of vindt men een toename in de tijd (bij twee opeenvolgende bepalingen) dan is er sprake van een virusinfectie.

Bij elke immunochemische bepaling moet op de een of andere wijze de binding tussen antistof en antigen zichtbaar gemaakt worden. 
Bepalingen die bij virussen (of de antistoffen ertegen) veel worden gebruikt zijn:
de ELISA ,
de Neutralisatietest.
de Hemagglutinatieremmingstest

ELISA
ELISA is de afkorting van Enzym Linked Immuno Sorbent Agar.
Sorbent wil zeggen dat de antistoffen (of antigenen) aan een vaste drager gekoppeld zijn. Deze drager kan een de binnenkant van een cupje in een ) microtiterbakje zijn, latexkorreltjes, of de binnenkant van een buis.
Enzyme Linked wil zeggen dat een ‘deelnemer’ in de reactie hetzij de antistof, hetzij het antigen gelabeld is met een enzym. De aanwezigheid van dit enzym en dus van (het daaraan gekoppelde antistof of antigen) wordt aan het eind van de bepaling zichtbaar gemaakt door het substraat toe te voegen. Deze verandert door de reactie met het enzym in een kleurstof die gemeten kan worden. Zie ook ELISA en antigenen
Belangrijk bij deze bepaling om tussen de verschillende stappen goed te wassen om niet gebonden reagentia te verwijderen.

 Neutralisatieproef

Kwalitatieve bepaling
Uitgangspunt (principe) van deze bepaling is dat wanneer men virus en passende antistoffen bij elkaar brengt het virus zijn werkzaamheid verliest en niet meer in staat is een dier ziek te maken of in een celcultuur een cytopathogeen effect te veroorzaken.

Kwantitatieve bepaling
Zoals zo vaak moet bij de kwantitatieve bepaling met verdunningen worden gewerkt. Hierbij moet het serum verdund worden. Bij elke verdunning van het serum wordt een gelijke hoeveelheid bekend virus gebracht . Hoe groter de verdunning waarbij nog juist neutralisatie optreedt, hoe meer antistoffen er in het (te bepalen) serum aanwezig waren.

Hemagglutinatieremmingstest
Bij deze test wordt gebruik gemaakt van het gegeven dat sommige virussen in staat zijn rode bloedcellen te laten agglutineren. Brengt men eerst virus en passende antistof bij elkaar en voegt men vervolgens rode bloedcellen toe dan zal bij een passende combinatie van antigen(virus) en antistof de agglutinatie geremd worden.

DNA / RNA bepalingen

De meest gebruikte methode om virussen te bepalen is demet DNA technieken. Hiermee kunnen ook genetische varianten van elkaar worden onderscheiden. Erg belangrijk om de pathogeniteit vast te stellen en ook mogelijke besmettingsroutes.


meer DNA: DNA, PCR, Sequensing, DNA typering, DNA chip

Plantenvirussen

Kweek

De kweek kan net als bij dieren plaatsvinden in de plant zelf of in celculturen. Bij planten bestaan de celculturen uit protoplasten, cellen zonder celwand, zodat er geen barrière voor het virus is om de cel binnen te komen.

Bepaling van plantenvirussen, kwantitatief en kwalitatief
De telling kan plaats vinden op de bladeren van zogenaamde overgevoelige planten. Dit zijn planten die na binnendringen van het virus rondom de geïnfecteerde cel een barrière vormen door de aangrenzende cellen onmiddellijk te laten afsterven. Deze zijn zichtbaar als bruine ringetjes of vlekjes. Het virus kan hierdoor niet verder groeien. Voor de telling brengt men het te bepalen monster op het blad samen met een beetje “schuurpoeder” waardoor de plant beschadigd raakt en de aanwezige virussen het blad kunnen binnendringen. Na groei van het virus kunnen ontstane plekjes geteld worden.
Verder worden dezelfde snelle bepalingen als voor dierpathogene virussen gebruikt, met name de PCR en de ELISA.

 

De bouw van een virus
De vermeerdering van een virus
Wat is het verschil tussen een bacterie en een virus?
Leeft een virus  wel of  niet?
Lysogenie
Transductie
Antivirale middelen
DNA en RNA virussen