Kiemgetal
Het aantal levende micro-organismen per milliliter of per gram.
1 ml van het monster of van een bekende verdunning wordt in een petrischaal gebracht.
In de schalen wordt een handwarme agarhoudende voedingsbodem (zie maken van een voedingsbodem) gegoten en het monster (verdunning) wordt goed gemengd met deze voedingsbodem.
Vervolgens koelt de voedingsbodem af, wordt stijf (door de aanwezigheid van de agar die "stolt") en na incubatie (lekker warm wegzetten in een stoof) wordt het aantal kolonies geteld en kan men via de aangelegde verdunningen terugrekenen (zie bij decimale verdunningen) hoeveel micro-organismen per ml aanwezig zijn.
Uitgangspunt bij deze bepaling is dat één micro-organisme één kolonie veroorzaakt. Deze kolonies ontstaan alleen op of in een vast oppervlak: elke bacterie blijft op zijn plaats, deelt zich een groot aantal keren waardoor een zichtbaar hoopje bacteriën ontstaat : de bacteriekolonie.
Mengplaatmethode en strijkplaatmethode
Het verschil tussen mengplaat en strijkplaatmethode is als volgt: Bij een mengplaat wordt 1 ml monster (of een verdunning ervan) in een petrischaal gebracht en daarna wordt handwarm agarhoudend medium toegevoegd, goed gemengd waarna het medium stolt. Bij een strijkplaat staan de goed gedroogde (waarom?) platen al klaar en wordt 0,1 ml van het monster (of een verdunning ervan) met een glazen hockeystick (drigalski-spatel) goed uitgestreken over het agaroppervlak. Kiemgetallen worden bijna altijd in duplo ingezet, dus twee platen per verdunning
De beoordeling van de platen
Platen met Bacillus cereus kolonies,
10x, 100 x en 1000 x verdund rijstmonster.
Welke platen worden geteld?
Na incubatie wordt het aantal kolonies per plaat geteld.
De 'ideale' plaat bevat tussen de 20 en 200 kolonies. Minder dan 20 is statistisch gezien minder gunstig. Boven de tweehonderd kolonies is de kans groot dat 1 kolonie door meer dan één bacteriecel is ontstaan ('overcrowding').
Is zo'n ideale plaat niet aanwezig dan moeten we roeien met de riemen die we hebben. Dus dan maar de platen met een paar kolonies tellen! Vervelender wordt het als we alleen platen met zeer veel kolonies tot onze beschikking hebben. Zijn het er zeer veel dan kan een kwart van de plaat geteld worden. Zit de plaat echt stampvol (boven de duizend kolonies) dan kan men op elke plaat twee keer het aantal kolonies op 1 cm2 tellen. Het gemiddelde hiervan bij een standaard petrischaal (diameter 9 cm) wordt vermenigvuldigd met een factor 100 en de verdunningsfactor en de uitkomst hiervan is het kiemgetal. Wel altijd vermelden dat het een overgroeide plaat betreft. Toch is zo'n uitslag altijd beter dan de vermelding ''niet te tellen'' !
De factor tien
Als het goed is, zitten er tussen de decimale verdunningen ook decimale verschillen in de uitkomsten op de platen. Breng je tien keer zo weinig monster op de plaat dan horen er ook tien keer zo weinig kolonies op de plaat te zitten. Let hier eens op, je kunt zo je eigen manier van werken beoordelen. Een uitzondering op de factor tien regel vindt men bij heel erg volle platen, hier zitten nooit tien keer zoveel op als de plaat met de tien keer lagere verdunning.(oorzaak?)
De berekening van het kiemgetal
Door het aantal kolonies te tellen van een verdunning van het monster weet je het kiemgetal. Gewoon door de verdunning met het aantal kolonies te vermenigvuldigen. Het klinkt zo simpel maar in de praktijk worden er veel vergissingen meegemaakt. Hier zijn wat oefeningen.
Strijkplaat vergeleken met mengplaat.
Denk er ook aan dat bij een strijkplaat 0,1 ml op een plaat wordt uitgestreken! Dus het aantal gegroeide kolonies zit in 0,1 ml van de getelde verdunning, in 1 ml dus 10 keer zo veel!
Daarna pas met de verdunningsfactor terugrekenen, in feite leg je met strijkplaten 10 keer zo hoge verdunningen aan.
Kolonievormende eenheden ( k.v.e's)
Het principe van de kiemgetalmethode is dat één micro-organisme één kolonie vormt. Dit is een theoretisch ideaal. Er zijn veel kanttekeningen bij te plaatsen. Bijvoorbeeld : de cellen vormen kluitjes of liggen in sliertjes, een kolonie ontstaat dan uit meerdere cellen. Groeien alle gezochte micro-organismen wel bij deze kweekomstandigheden? Om deze discussies te voorkomen spreekt men niet over het aantal levende micro-organismen maar over het aantal kolonievormende eenheden.
Het noteren van het kiemgetal
Geef kiemgetallen beneden de 100 als zodanig op. Geef hogere kiemgetallen als volgt op: >N = a * 10b
a is een getal met één cijfer voor en één cijfer achter de komma b is een geheel getal niet kleiner dan twee 2,5 * 108 per ml en niet 253 * 106 per ml
72 per gram en niet 7,2 * 101 per gram .
Vermeld ook altijd welke micro-organismen zijn geteld, dus coliformen, enterobacteriën, Bacillus cereus, schimmels en gisten. Die keuze is (vooraf) mogelijk dankzij de selectieve voedingsbodem, voor elke belangrijke groep/soort zijn er aparte voedingsbodems.
Vermeld ook de kweekomstandigheden : incubatietijd, incubatietemperatuur en de gebruikte voedingsbodem.
Welke verdunningen worden er ingezet?
Achteraf bij het kolonies tellen weet je eigenlijk pas wat de ideale verdunning voor het monster was. Omdat je uiteraard van te voren het kiemgetal niet weet, worden er meestal drie of meer opeenvolgende decimale verdunningen ingezet. Anders wordt het, als men de afkeuringgrens* van het product voor het onderzochte micro-organisme kent. Met deze grens kun je uitrekenen welke verdunning laat zien of de grens wordt overschreden. Hier gaan we ook klassikaal mee oefenen.(MBO Life Sciences) Uit ervaring weet men ook vaak hoeveel micro-organismen men in een bepaald product kan verwachten.
hieronder nog wat achtergrondinformatie
*Afkeuringgrens=Norm
Het vaststellen van de norm (grenswaarde) hangt van veel zaken af:
Het te bepalen micro-organisme, bij een algemeen kiemgetal is de norm hoger (minder streng:het aantal micro-organismen mag hoog zijn) dan bij de bepaling van een ziekteveroorzakend micro-organismen zoals Salmonella.
Voor ziekteverwekkers wordt de eis geformuleerd in termen van afwezigheid in een bepaald hoeveelheid in te zetten product.
De aard van het product: wordt het direct geconsumeerd? of moet het eerst nog verhit worden (door de consument)? In het laatste geval mogen er meer micro-organismen in zitten.
Heeft het nog een lange weg te gaan? Zijn er dan groeimogelijkheden ?
De consument : is het een gezonde volwassene of bestaat de doelgroep uit babys , bejaarden, zieken die een verminderde weerstand hebben?
Het nemen van het monster
Monstername is een vak apart (google maar eens op monstername)
Wat wil je een "eerlijke" indruk van je product? of juist het slechtste plekje in een partij opsporen? Hoeveel monsters moet je nemen om een betrouwbaar resultaat te krijgen? Zijn de micro-organismen wel gelijkmatig over het product verdeeld? (heel vaak niet dus : alleen aan het oppervlak, in "nestjes" dat zijn kleine broedplaatsjes van micro-organismen, alleen onderin).
En welke stadia van een productieproces bemonster je?
De bepaling zelf
De kiemgetalbepaling lijkt eenvoudig, maar niets is wat het lijkt dus ook dit niet:
De bepaling is van zeer veel factoren afhankelijk:
transport monster
behandeling monster (wijze van homogeniseren/verdunnen)
kwaliteit/batch voedingsbodem
temperatuur
Al deze factoren dienen zo constant mogelijk gehouden worden en moeten gemeten/geconroleerd worden
Varianten op het kiemgetal:(naast strijk en mengplaat)
Petrifilmmethode:
Een dunne onderlaag (film) waarin de kant en klare voedingsbodem zich bevindt, waarop het monster wordt aangebracht en een bovenlaag van folie vervangen de petrischaal en de voedingsbodem. De folie wordt opgelicht het monster aangebracht en de folie wordt weer terugelegd en de petrifilm wordt geincubeerd. Het systeem bespaart tijd en ruimte.
Membraanfiltratiemethode:
Als bijvoorbeeld 100 ml drinkwater of andere vloeistof moet worden onderzocht op de aanwezigheid van levende bacteriecellen dan kan die 100 ml niet in een petrischaal. Wat wel kan is het water door een bacteriefilter (membraanfilter) zuigen en dan het membraan (met de bacterien en al) op een al klaarstaande voedingsbodem leggen en incuberen. De voedingsstoffen gaan door het membraan en tijdens de incubatie groeien ze uit tot kolonies.
Stempelplaatmethode:
Voor onderzoek naar de hygiëne is er het microbiologisch onderzoek van oppervlakken: aanrecht, smartphone, deurkruk.
Hierbij moet de agar=voedingsbodem afgedrukt worden op het oppervlak. Dat kan met speciale schaaltjes waarin de voedingsbodem en soort stempelkussen wordt:
Dit kan op vlakke voorwerpen worden afgedrukt: let op! voedingsbodem eerst laten drogen, en bij gedesinfecteerde, schoongemaakte oppervlakken een neutralisatiemiddel toevoegen aan de voedingsbodem (anders kunnen de bacterien niet uitgroeien tot zichtbare kolonies).
Dip slide:
Dit is een klein plaatje met aan beide zijden een agarhoudende voedingsbodem, Dit plaatje kan op een vlak voorwerp worden gedrukt of in een te onderzoeken vloeistof worden gedompeld. Daarna kan het in in de verpakking geincubeerd worden.
Swabmethode:
Een hol of bol voorwerp (lepel) kan met een swab (wattenstokje, steriel) worden afgestreken. Daarna kan de swab uitgestreken worden op een gewone voedingsbodem in een petrischaal.
Wil je bacterien echt tellen dan kan de swab ook in een vloeistof worden uitgeschud en de vloeistof daarna verder onderzocht worden.
Luchtonderzoek:
Een bekende hoeveelheid lucht (100 of 1000 liter) wordt aangezogen en over een petrischaal met voedingsbodem geleid. De platen worden in de stoof gezet en na groei worden de kolonies geteld.
Hygiëneonderzoeken met een zeer snel resultaat zijn de ATP en de NADH bepaling.
Welke bacteriën ga je "tellen"?
Je kunt bepalen welke bacteriën geteld moeten worden. Gewoon een selectieve voedingsbodem gebruiken, die vaak ook nog electief is.
Welke micro-organismen zijn nuttig om te bepalen?
Bij levensmiddelenmicrobiologie zijn dat de Indicatororganismen en indexorganismen.